5 étapes de préparation des échantillons se succèdent :
1. La fixation :
La fixation est réalisée immédiatement après le prélèvement de l’échantillon à observer. Elle permet d’immobiliser et de conserver l’échantillon dans le temps, dans un état proche du vivant. Elle peut être réalisée par un liquide fixateur ou par congélation.
– La fixation en liquide fixateur est réalisée en plongeant le matériel biologique dans une solution de formol.
– La fixation par congélation consiste à plonger l’échantillon dans un milieu de congélation des tissus (liquide à température ambiante et solide à -20°C). Le tout est ensuite refroidi dans de l’azote liquide. L’échantillon congelé est conservé jusqu’à la réalisation des coupes. Cette étape est réalisée dans un moule en respectant l’orientation choisie pour la coupe ultérieure.
2. L’inclusion :
L’inclusion suit la fixation en liquide fixateur. Elle consiste à rigidifier l’échantillon avec un milieu d’inclusion de paraffine, afin de pouvoir procéder à la coupe ultérieure.
Pour cela, il est nécessaire de déshydrater au préalable l’échantillon en remplaçant l’eau qu’il contient par de l’éthanol. L’éthanol est non miscible avec la paraffine, il est donc substitué par une solution (clarifiant) miscible avec la paraffine.
Suite à la clarification, les échantillons sont plongés dans des bains de paraffine. Ces étapes sont réalisées à l’aide d’un automate de déshydratation.
L’étape suivante d’inclusion est réalisée à l’aide d’une table d’inclusion. Elle consiste à orienter l’échantillon dans un moule contenant de la paraffine en fusion, en veillant à respecter le plan de coupe. Le bloc qui en résulte est enfin refroidi.
L’échantillon est ensuite coupé au microtome.
3. La coupe :
Les coupes sont réalisées par microtomie ou cryotomie. La coupe est une étape importante de la préparation des lames car elle conditionne la bonne observation de l’échantillon en microscopie.
– Les échantillons inclus en paraffine sont coupés de façon transversale avec un microtome, en fines tranches de 5 micromètres. Les lames de verre sont recouvertes d’une solution contenant un additif permettant d’optimiser l’accroche de la coupe déposée sur la lame. Les lames sont ensuite placées sur des plaques chauffantes afin d’aider au bon étalement de l’échantillon. Le liquide résiduel est retiré à la main après réchauffement de la lame. Les lames sont ensuite séchées à température ambiante.
– Les échantillons congelés sont coupés à l’aide d’un cryotome. Les coupes à congélation sont ensuite déposées sur une lame de verre pour stockage à -80°C.
Bioalternatives évalue les conditions de fixation et de coupe adaptées à votre échantillon et à votre étude.
Le choix de ces conditions de préparation est capital afin de minimiser les artéfacts. L’inclusion en paraffine est privilégiée pour préserver la morphologie des tissus ; la congélation est plus adaptée pour préserver l’ADN et l’ARN et pour le marquage d’éléments solubles ou sensibles au milieu de fixation.
4. La coloration ou l’immunomarquage :
– La coloration permet d’accentuer les contrastes afin de reconnaître et de différencier des éléments constitutifs du matériel biologique.
L’échantillon est déparaffiné et réhydraté au préalable afin de permettre aux colorants polaires d’imprégner les tissus. Ainsi, les différents colorants peuvent entrer en contact avec les éléments à colorer en fonction de leur affinité.
Une fois la coloration effectuée, la lame est rincée et déshydratée pour le montage.
Nous proposons un large choix de colorations standards et de colorations spéciales. Pour toute demande de coloration spéciale, contactez nos équipes!
– L’immunomarquage permet de mettre en évidence des constituants cellulaires et tissulaires spécifiques (antigènes) grâce à l’utilisation d’anticorps polyclonaux ou monoclonaux.
L’échantillon est mis en présence de la solution contenant l’anticorps puis il est lavé afin de retirer les anticorps non fixés.
Notre équipe peut réaliser des marquages par méthode directe et indirecte en utilisant des anticorps couplés à des fluorochromes (immunofluorescence) ou à des enzymes réagissant avec des chromogènes (immunohistochimie).
Notre laboratoire d’histologie est à votre disposition pour toute demande d’immunomarquages, de recherche et validation d’anticorps et de co-marquage. N’hésitez pas à nous contacter !
5. Le montage :
Les coupes sont montées entre lames et lamelles avec un produit permettant leur adhérence. Les lames sont prêtes à être stockées ou observées.
Pour les observations en microscopie à fluorescence, un milieu de montage est utilisé afin de diminuer temporairement la perte de fluorescence.
